La centrifugación es una técnica ampliamente utilizada en el análisis y la separación de mezclas de partículas, células, orgánulos o moléculas. Su principio básico radica en la aplicación de una fuerza centrífuga que acelera el proceso de sedimentación, permitiendo la separación de los componentes de la muestra. En este artículo, exploraremos los fundamentos teóricos de la centrifugación, así como los aspectos cuantitativos y el instrumental utilizado.
Teoría de la centrifugación y aspectos cuantitativos
La teoría de la centrifugación se basa en la sedimentación de partículas bajo la influencia de una fuerza centrífuga. Para comprender mejor este proceso, se pueden consultar obras como “Luque” (p.123) o “Freifelder” (p.298). La velocidad, el tiempo y la temperatura son parámetros que se pueden regular en la centrifugación, y las velocidades utilizadas suelen ser elevadas, en el rango de 102-105 rpm.
Instrumental utilizado en la centrifugación
Tubos
De vidrio o plástico. Resistentes químicamente (disolventes, reactivos) y físicamente (tensión a las velocidades elevadas que se emplean). Diversos tamaños y formas. Plásticos especiales para altas velocidades.
Se puede regular velocidad, tiempo, temperatura. Elevadas velocidades (102-105 rpm).
Rotores
Modalidades de centrifugación
La centrifugación se puede clasificar en diferentes modalidades según la velocidad y el propósito:
Según la velocidad:
| Criterio aproximado: | |
Centrifugación a baja velocidad | menos de 10.000 rpm |
| Centrifugación a alta velocidad | entre 10.000 y 20.000 rpm |
| Ultracentrifugación | más de 20.000 rpm |
Según el propósito:
Centrifugación analítica:
Objetivo: se utiliza para medir las propiedades físicas de las partículas que sedimentan, tales como su coeficiente de sedimentación o su masa molecular. Especialmente en la variante ultracentrifugación analítica.
Las moléculas se observan mediante un sistema óptico durante la centrifugación. Los tubos de centrífuga deben ser de cuarzo para dejar pasar la luz visible y ultravioleta. Rotor basculante, observación en vertical.
Centrifugación preparativa:
De uso más común. Objetivo: aislar partículas, células o moléculas para su análisis o utilización posterior. En general, se emplea mayor cantidad de muestra que en la analítica.
Tipos de centrifugación según el medio y la aplicación
Existen diferentes tipos de centrifugación según el medio en el que se realiza y la forma en que se aplica la muestra:
Centrifugación diferencial
(También llamada de frontera móvil). El tubo se llena con muestra y se centrifuga. El comportamiento de cada componente de la muestra depende de su forma, tamaño, densidad y, lógicamente, de las condiciones de centrifugación. Se obtienen sólo 2 fracciones: sedimento y sobrenadante.
[Nota: la palabra precipitado es más adecuada para algo insoluble, que precipita por centrifugación o por otros mecanismos (por ej., una reacción química); sedimento es más correcto para lo que se ha forzado a ir al fondo pero seguiría siendo soluble; pellet es una palabra inglesa para lo que queda compactado en el fondo como consecuencia de la centrifugación]
Una aplicación típica es el fraccionamiento subcelular (separación de los distintos componentes de una célula, principalmente de los orgánulos) (véase Luque o Alberts) empleando sucesivas centrifugaciones a velocidad creciente.
Centrifugación zonal o de velocidad de sedimentación
La muestra se aplica en una capa delgada sobre el medio de centrifugación, que es un gradiente de densidad. Bajo la fuerza centrífuga, las partículas sedimentan a través del gradiente concentrándose en zonas o bandas discretas. Su velocidad de avance (y, por tanto, el mecanismo de la separación) depende de su tamaño, forma y densidad; todos estos parámetros se combinan en el coeficiente de sedimentación,
Coeficiente de sedimentación=s=velocidad de sedimentaciónaceleración centrífugaCoeficiente de sedimentación=s=velocidad de sedimentaciónaceleración centrífuga
que se mide en unidades svedberg (1 S = 10−13 segundos).
La centrifugación debe terminar antes de que alguna de las partículas separadas llegue al fondo del tubo. Los componentes separados se recogen individualmente aspirando con mucho cuidado las diferentes bandas o, mejor, perforando el fondo del tubo y recogiendo en fracciones el líquido que cae.
El gradiente de densidad se crea mediante un gradiente de concentración: concentraciones crecientes, al bajar en el tubo, de un componente adecuado. Se usan para ello sacarosa, cloruro de cesio, albúmina, suero fetal bovino…, o medios comerciales como Ficoll –un polisacárido sintético–, Percoll, metrizamida….
Se puede preparar:
a) un gradiente discontinuo o escalonado, manualmente
b) un gradiente continuo, empleando un dispositivo formador de gradientes
c) un gradiente continuo autoformado, si se crea mediante centrifugación, normalmente a la vez que se fracciona la muestra
Centrifugación zonal.
- A) Preparación de un gradiente continuo de densidad usando un mezclador.
- B) Aplicación de la muestra sobre el gradiente.
- C) Colocación de los tubos en un rotor basculante y centrifugación.
- D) Recogida en fracciones de los componentes separados.
Con esta técnica se consigue, por ejemplo, separar todos los tipos celulares sanguíneos, purificar espermatozoides viables, separar células viables y no viables de tejidos desagregados y muestras con células en suspensión, etc
Centrifugación isopícnica o de equilibrio de sedimentación
Se utiliza también un gradiente de densidad, pero en este caso el tiempo de centrifugación es lo suficientemente largo (hasta 1 o 2 días) como para que se alcance el equilibrio de sedimentación (entre la fuerza centrífuga, el empuje hidrostático de la célula y su difusión). Para conseguirlo, se usan gradientes continuos que cubren todo el intervalo de densidades de los componentes de la muestra: en el fondo del tubo la densidad del medio ha de ser mayor que la del componente más denso. De esta forma, independientemente del tiempo de centrifugación, las partículas, células, etc. nunca sedimentarán en el fondo, sino que alcanzan una posición estable intermedia en el gradiente, donde se concentran en una banda muy estrecha (mejor resolución). Lo más frecuente es mezclar la muestra con el material que formará el gradiente y generar un gradiente autoformado a la vez que se hace la separación. Requiere velocidades muy altas (ultracentrifugación) para que se forme el gradiente.
Además de la mayor resolución, lo interesante de esta técnica es que separa exclusivamente según la densidad de los componentes de la muestra, que se sitúan en la posición del gradiente donde la densidad del medio es igual a la suya propia (isopícnica = de igual densidad, en griego).
Comparación e información adicional:
| Rotor angular, generalmente. Separación en función principalmente del tamaño, pero también del coeficiente de sedimentación s, que depende de la masa (tamaño × densidad) y de la forma. (medido en Svedbergs, 1S = 10-13 segundos) Aplicación: separación de tipos celulares, fraccionamiento subcelular (separación de orgánulos), separación de asociaciones macromoleculares, etc. | Rotor basculante. Separación en función del coeficiente de sedimentación s, que depende de masa y forma. El gradiente evita la mezcla por convección/difusión: bandas bien separadas. Se detiene la centrifugación antes de alcanzar el equilibrio. Densidad máxima del gradiente < densidad de los componentes de la muestra. Aplicación: separación de macromoléculas, de orgánulos similares, etc. |
4. Métodos de barrera
Método rápido, típico por ejemplo en la obtención de leucocitos de sangre circulante libres del resto de células sanguíneas. Se trata de una centrifugación a través de un medio de densidad constante (se podría considerar como un gradiente escalonado de una sola etapa). La densidad de este lecho debe ser intermedia entre la de los tipos celulares que se quieren separar. Se emplean para ello medios comerciales como Ficoll-Paque, Lymphoprep y otros muchos, formados generalmente por mezclas de Ficoll (un polisacárido sintético) y metrizamida (un compuesto sintético yodado). Se dispone de varios medios con densidades adecuadas para la separación de tipos celulares concretos; por ej., Nycoprep 1.077 para células mononucleares, Nycoprep 1.068 para monocitos, Polymorhoprep para células polimorfonucleares, o Nycoprep 1.063 para plaquetas.
Cálculos
Conversión de velocidad de giro (revoluciones por minuto, rpm) a aceleración centrífuga (fuerza centrífuga relativa, FCR, sin unidades):
Se conseguirá una misma separación en 2 centrífugas distintas cuando sea igual FCR, no si es igual la velocidad de giro (rpm). Es importante, por ello, dar las condiciones de centrifugación en FCR, no en rpm.
La FCR es lo que coloquialmente se llama “número de ges”, porque se mide empleando como unidad la aceleración de la gravedad, g. Se expresa así, por ej., “una centrifugación de 15 min a 20.000 g” (o “a 20.000 × g ”).
La relación entre ambas depende del radio del rotor (medido desde el eje de giro hasta la posición de la muestra en el tubo) así:
La separación por centrifugación depende de la masa celular (mm), del radio de giro del tubo —o radio del rotor— donde se coloca la muestra (rr) y de la velocidad alcanzada por la centrífuga (ωω o nn):
Fc=m⋅a=m⋅v2r=m⋅e2r⋅t2=m⋅ϕ2⋅r2r⋅t2=m⋅ϕ2⋅rt2=m⋅ω2⋅r=Fc=m⋅a=m⋅v2r=m⋅e2r⋅t2=m⋅ϕ2⋅r2r⋅t2=m⋅ϕ2⋅rt2=m⋅ω2⋅r=
=m⋅(2π)2⋅n2⋅r=39,48⋅m⋅n2⋅r=m⋅(2π)2⋅n2⋅r=39,48⋅m⋅n2⋅r
Siendo:
FcFc = fuerza centrifuga
mm = masa de la célula
a=v2ra=v2r = aceleración; si se trata de sedimentación a gravedad unidad, a=g=a=g= 9,8 m/s2 = 980 cm/s2
v=etv=et = velocidad lineal de la muestra en el tubo (cm/min)
rr = radio de giro, medido entre el punto medio del tubo de centrífuga y el eje de rotación (cm)
ee = espacio lineal recorrido, si el movimiento fuese lineal (cm)
tt = tiempo de sedimentación empleado al centrifugar (min)
ϕϕ = ángulo recorrido en el movimiento de rotación (radianes = ángulo cuyo arco es igual a rr); ϕ=erϕ=er
ω=ϕtω=ϕt = velocidad angular, pues el movimiento es de rotación (rad/min = min−1)
nn = velocidad de giro (revoluciones por segundo = rps, o revoluciones por minuto = rpm); ω=2π nω=2π n
Calculando la fuerza centrífuga relativa:
FCR=FcFg=ag=39,48⋅m⋅n2⋅rm⋅980cms2=0,0403⋅n2⋅r cm−1⋅s2FCR=FcFg=ag=39,48⋅m⋅n2⋅rm⋅980cms2=0,0403⋅n2⋅r cm-1⋅s2
Si separamos las unidades habituales (velocidad en rpm y radio en cm):
n=(nrpm)⋅rpm=(nrpm)⋅1min=(nrpm)⋅160sn=(nrpm)⋅rpm=(nrpm)⋅1min=(nrpm)⋅160s ; r=(rcm)⋅cmr=(rcm)⋅cm
Tenemos:
FCR=0,0403⋅((nrpm)2⋅13600 s2)⋅((rcm)⋅cm)⋅cm−1⋅s2=11,19⋅10−6⋅(nrpm)2⋅(rcm)FCR=0,0403⋅((nrpm)2⋅13600 s2)⋅((rcm)⋅cm)⋅cm-1⋅s2=11,19⋅10-6⋅(nrpm)2⋅(rcm)
Que habitualmente se escribe como FCR=11,19⋅10−6⋅n2⋅rFCR=11,19⋅10-6⋅n2⋅r o bien FCR=n2⋅r89365FCR=n2⋅r89365
lo que presupone que nn está en rpm y rr en cm
Como ejemplo, veamos un ejercicio resuelto:
El nº de gg alcanzado en un rotor de centrífuga de 5 cm de radio, que gira a una velocidad de 10 000 rpm es:
FCR=(10000)2⋅589365=5600×gFCR=(10000)2⋅589365=5600×g
Conviene saber manejar esta conversión.
Si quieres saber más sobre centrifugas puedes visitar nuestro blog: Centrifugas ¿Cómo funciona?
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Fuente: http://biomodel.uah.es/tecnicas/centrif/inicio.htm
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